Zastosowania eksperymentalne i rozwiązania do rozwiązywania problemów z rurkami odśrodkowymi do ultrafiltracji

Rurka wirówkowa do ultrafiltracji jest powszechnie stosowanym urządzeniem do filtracji membranowej w laboratorium. Jego głównym składnikiem jest membrana ultrafiltracyjna o określonej masie cząsteczkowej. Typowe materiały na membrany ultrafiltracyjne obejmują polieterosulfon (PES) i regenerowaną celulozę (RC). Zasada działania ultrafiltracyjnej rurki wirówkowej polega na wykorzystaniu siły odśrodkowej i przesiewania opartego na-wielkości- molekularnej w celu przepuszczenia małych cząsteczek przez membranę ultrafiltracyjną, umożliwiając w ten sposób szybkie zatężanie, odsalanie, wymianę buforu lub oczyszczanie i oddzielanie biomakromolekuł, takich jak białka i kwasy nukleinowe.

 

Wybór MWCO

Białko	Zalecane MWCO	Zalecany czas wirowania
6–20 kDa	3 kDa	40 minut
20–30 kDa	5 kDa	30 minut
30–60 kDa	10 kDa	20 minut
60–100 kDa	30 kDa	20 minut
100–200 kDa	50 kDa	15 minut
200–600 kDa	100 kDa	15 minut
>600 kDa	300 kDa	15 minut
Jedno- lub dwuniciowe-cząsteczki kwasu nukleinowego	Zalecane MWCO	Zalecany czas wirowania
137–1159 p.n.e	30 kDa / 100 kDa	10 min (wirnik-o stałym kącie, 5000 × g)
Nanokoraliki	Zalecane MWCO	Zalecany czas wirowania
1,5–2 nm	3 kDa	40 minut
2–3 nm	5 kDa	30 minut
3–5 nm	10 kDa	20 minut
5–7 nm	30 kDa	20 minut
7–10 nm	50 kDa	15 minut
10–30 nm	100 kDa	15 minut
>30 nm	300 kDa	15 minut

 

W przypadku białek zaleca się wybranie MWCO błony 2–6 razy niższej niż masa cząsteczkowa białka docelowego. Jeśli brane jest pod uwagę również natężenie przepływu, zaleca się MWCO membrany poniżej tego zakresu 2×–6×.

 

Przypadek zastosowania (DNA z komórek straconych)

W przypadku metody konwencjonalnej wycięto kawałek gazy o wymiarach 2,5 cm x 2 cm, poddano lizie w systemie o małej-objętości i bezpośrednio oczyszczono za pomocą urządzenia. W przypadku metody zatężeniowej powierzchnię pobierania próbek gazy zwiększono dwukrotnie. Po lizie supernatant po trawieniu przeniesiono do probówki wirówkowej do ultrafiltracji 100 kDa, zatężono przez wirowanie przy 10 000 obr./min, odzyskano przez wirowanie w odwróconej pozycji, a następnie poddano ekstrakcji DNA przy użyciu w pełni zautomatyzowanego urządzenia do oczyszczania kwasów nukleinowych. Objętość elucji ustalono równomiernie na 40 µl, aby zapewnić, że początkowe poziomy komórek w obu grupach były zasadniczo porównywalne.

 

Badania ilościowe wykazały, że średnie stężenie DNA wyniosło 0,099 ± 0,041 ng/μL dla metody konwencjonalnej i 0,193 ± 0,068 ng/μL dla metody zatężeniowej. Różnica pomiędzy obiema grupami była istotna statystycznie (p < 0,01). Całkowita wydajność DNA uzyskana metodą zatężania była 1,95 razy większa niż w przypadku metody konwencjonalnej, co pokazuje, że etap zatężania poprzez ultrafiltrację nie powodował prawie żadnych strat całkowitego DNA. Wartości Ct w obu grupach wynosiły odpowiednio 27,64 ± 0,39 i 27,58 ± 0,40, przy P > 0,01, co wskazuje, że leczenie ultrafiltracją nie wprowadziło inhibitorów amplifikacji PCR ani nie zakłócało późniejszych reakcji amplifikacji.

 

W przypadku genotypowania STR kompletny genotyp zdefiniowano przez pełne prążki w każdym locus i średnią wysokość piku większą lub równą 200 RFU. Spośród 20 równoległych próbek konwencjonalna metoda dała pełne genotypy tylko dla 14 próbek, podczas gdy metoda zagęszczania pozwoliła uzyskać pełne genotypowanie STR dla wszystkich 20 próbek, znacznie poprawiając efektywny współczynnik wykrywania genotypowania w śladowych próbkach kontaktowych.

Rurki wirówkowe do ultrafiltracji Guidling Technology charakteryzują się prostą obsługą, wysokimi współczynnikami stężenia i wysokim współczynnikiem odzyskiwania próbek i są szeroko stosowane w biochemii, biologii molekularnej i innych dziedzinach. Stopień odzysku ultrafiltracyjnych rurek wirówkowych Guidling Technology różni się w zależności od przetwarzanego materiału i ogólnie może przekraczać 90%.

 

Wspólne rozwiązywanie problemów

Problem	Możliwa przyczyna	Rozwiązanie
Podczas koncentracji następuje wytrącanie	Koncentracja jest zbyt szybka	Zmniejsz prędkość wirowania
		Użyj rurki ultrafiltracyjnej o wyższej masie cząsteczkowej
		Pipetować w górę i w dół w probówce odśrodkowej, a następnie ponownie odwirować
	Nadmierna-koncentracja	Zaleca się, aby końcowe stężenie białka po zatężeniu nie przekraczało 20 mg/ml
Nie można przefiltrować wody	Membrana ultrafiltracyjna jest całkowicie sucha, a powierzchnia membrany staje się słabo hydrofobowa	Zwilż membranę rozpuszczalnikiem o niskim-powierzchniowym-naprężeniu (np. wykonaj wstępne wirowanie z 20% etanolem w wodzie)
Koncentrat nie zawiera białka docelowego	Początkowe stężenie próbki białka jest zbyt niskie (< 25 μg/mL)	Jeśli stężenie próbki jest niskie, a objętość duża, należy kilkakrotnie załadować próbkę i wirować
	Nieprawidłowy wybór MWCO membrany	MWCO błony jest na ogół mniejsze niż 2-krotność masy cząsteczkowej docelowego białka lub większe
	Siła odśrodkowa jest poza określonym zakresem	Zalecana siła odśrodkowa: 3000–5000 × g
	Docelowe białko wytrąciło się	Dostosuj docelowe stężenie białka w koncentracie (dostosuj współczynnik koncentracji)
		Kontroluj temperaturę i pH
		Używaj dodatków
		Dostosuj siłę jonową
Zakłócenia występują podczas dalszej analizy stężonego białka	Membrana ultrafiltracyjna zawiera śladowe ilości gliceryny	Przepłucz-wstępnie rurkę ultrafiltracyjną buforem i oczyszczoną wodą. Jeśli zakłócenia nie ustąpią, oczyścić 0,1 M NaOH, następnie spłukać oczyszczoną wodą i odwirować
Zanieczyszczenie RNazą	Nie ma gwarancji, że rurka ultrafiltracyjna będzie wolna od RNazy-	Zaleca się moczenie w 0,1% DEPC w temperaturze 37 stopni przez 2 godziny, aby całkowicie inaktywować RNazę; pozostałości DEPC można usunąć poprzez spłukanie oczyszczoną wodą
Zanieczyszczenie endotoksynami	Dostarczone rurki ultrafiltracyjne nie zostały poddane zabiegowi usuwania-endotoksyn, a endotoksyny są powszechnie obecne w przyrodzie	Przed eksperymentem-umyj wstępnie 0,5 M NaOH, a następnie spłucz oczyszczoną wodą, aby usunąć większość endotoksyn