Filtracja z przepływem stycznym TFF w połączeniu z ultrawirowaniem w celu wydajnego przygotowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (sEV) to pęcherzyki w skali nano wydzielane przez komórki, które zawierają kwasy nukleinowe, białka, małe cząsteczki i inne składniki i odgrywają ważną rolę w komunikacji międzykomórkowej. Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe typu egzosomalnego- wykazują duże podobieństwo do komórek macierzystych. W porównaniu ze sztucznymi nanocząstkami wykazują niższy współczynnik klirensu immunologicznego i niższą cytotoksyczność, co czyni je obiecującymi kandydatami na nowatorskie rozwiązania.pojazdy do dostarczania leków in vivo. Prawie wszystkie typy komórek mogą wydzielać te pęcherzyki, a badania nad ich zastosowaniem jako nośników leków stopniowo przechodzą z laboratorium do zastosowań klinicznych. Jednakże,głównym wąskim gardłem pozostaje produkcja-na dużą skalę.

 

Aktualne metody izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Obecne metody izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych obejmująultrawirowanie, wirowanie w gradiencie gęstości, chromatografia-wykluczeniowa (SEC) i wytrącanie glikolem polietylenowym (PEG).

Wytrącanie PEG zapewnia wysoką wydajność i prostą obsługę, ale wiąże się ze znacznym zanieczyszczeniem niepożądanymi białkami. Wirowanie w gradiencie gęstości i chromatografia-wykluczania wielkościowego mogą zapewnić produkty o wysokiej-czystości, ale ich wydajność jest stosunkowo niska, a procesy są-czasochłonne. Ultrawirowanie jest szeroko stosowane, ale wielkość jego przetwarzania jest ograniczona wydajnością wirówki, co utrudnia zwiększanie skali.

 

Zastosowanie filtracji z przepływem stycznym do separacji sEV

Filtrację z przepływem stycznym (TFF) zastosowano już do separacji nanocząstek, takich jak liposomy i wektory lentiwirusowe. W TFF nadawa przepływa stycznie po powierzchni membrany, co pomaga zmniejszyć zanieczyszczanie membrany i ułatwia zwiększenie skali procesu.

Ponieważ małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe zazwyczaj wahają się od30–200 nmśrednicy, AKaseta membranowa o grubości 0,45 µmmożna wybrać w systemie TFF w celu usunięcia większych białek i pęcherzyków, podczas gdy aKaseta membranowa 300 kDamożna stosować do usuwania białek o małej-masie cząsteczkowej i zagęszczania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych obecnych w pożywce hodowlanej.

 

Charakterystyka surowca po separacji TFF

Analiza śledzenia nanocząstek (NTA) wykazała, że ​​rozkład średnic cząstek mieścił się głównie w zakresie:0–250 nm.

 

 

Jednakże transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) ujawniła dużą ilość zanieczyszczającego białka, podczas gdy nie zaobserwowano żadnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Wyniki te wskazują, że w celu dalszego oczyszczenia pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wymagany był dodatkowy etap oczyszczania.

 

Charakterystyka koncentratu TFF po ultrafiltracji 100 kDa

Koncentrat TFF poddano dalszej obróbce przy użyciu aRurka ultrafiltracyjna 100 kDa.

NTA wykazała, że ​​średnice cząstek w koncentratach otrzymanych po jednej i dwóch rundach ultrafiltracji utrzymywały się głównie w granicach0–250 nm. Dwukrotne wykonanie ultrafiltracji spowodowało jednak znaczne zmniejszenie liczby uzyskanych cząstek.

Analiza TEM wykazała, że ​​nie zaobserwowano żadnych struktur-podobnych do pęcherzyków ani w koncentratach do ultrafiltracji jedno-, ani dwu-, natomiast pozostała znaczna ilość zanieczyszczającego białka.

Dlatego,Nie można skutecznie zastosować ultrafiltracji 100 kDa do oczyszczenia pożywki hodowlanej po zatężeniu TFF.

 

 

Charakterystyka koncentratu TFF oczyszczonego przez ultrawirowanie

NTA wykazała, że ​​średnice cząstek oczyszczonych produktów mieściły się głównie w zakresie0–250 nm.

Co ważne, TEM wyraźnie ujawnił-struktury przypominające pęcherzyki w różnych polach widzenia. Wyniki te wykazały, że po zatężeniu pożywki hodowlanej za pomocą TFF,ultrawirowanie można następnie zastosować do dalszego rozdzielania i oczyszczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.

 

 

Charakterystyka sEV wyizolowanych z pożywki kondycjonowanej mezenchymalnych komórek macierzystych przy użyciu TFF w połączeniu z ultrawirowaniem

NTA wykazała, że ​​średnice cząstek oczyszczonych produktów mieściły się głównie w zakresie0–250 nm.

Za pomocą TEM zaobserwowano struktury-podobne do pęcherzyków. Analiza Western blot wykazała pozytywną ekspresję białek związanych z pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi-CD9, CD63 i ALIXw oczyszczonych pęcherzykach zewnątrzkomórkowych.

Wyniki te potwierdziły, że oczyszczone małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe zawierały egzosomy, co wskazuje, że tę metodę można również zastosować doizolacja i ekstrakcja egzosomów.

 

 

Wniosek: TFF w połączeniu z ultrawirowaniem w celu uzyskania-wysokiej jakości przygotowania sEV

Badanie to wykazałoSamo stężenie TFFw rezultacie otrzymano produkt zawierający znaczną ilość zanieczyszczających białek i dlatego był niewystarczający do uzyskania kwalifikujących się pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.

Podobnie, używając aRurka ultrafiltracyjna 100 kDa do wtórnego oczyszczanianie dały skutecznie nienaruszonych struktur pęcherzykowych.

Łącząc zatężanie TFF z późniejszym oczyszczaniem przez ultrawirowanie, można połączyć zalety obu technikwysokiej jakości-produkty zawierające małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe.

W porównaniu z samym konwencjonalnym ultrawirowaniem, połączony proces może być skutecznyskrócić całkowity czas przetwarzania i poprawić skuteczność separacji.

W tym przepływie pracyTFF umożliwia szybkie wzbogacanie-próbek o dużej objętości, zajmując się ograniczeniami konwencjonalnego ultrawirowania w przetwarzaniu dużych objętości próbek. Następnie ultrawirowanie powoduje głębokie oczyszczenie w celu usunięcia-skoncentrowanych zanieczyszczeń białkowych, pomagając jednocześnie zachować czystość i integralność pęcherzyków.

Ponadto sposób ten nie wymaga dodawaniaegzogenne chemiczne odczynniki strącające, pomagając w jak największym stopniu zachować aktywność biologiczną pęcherzyków.

Z punktu widzenia tłumaczeń przemysłowych proces ten ma znaczenieskaluj-potencjałi może pomóc stawić czoła wyzwaniom związanym z-produkcją pęcherzyków zewnątrzkomórkowych na dużą skalędostarczanie leków, medycyna regeneracyjna i powiązany rozwój produktów. Zapewnia także solidną podstawę eksperymentalną do późniejszej optymalizacji procesów i produkcji na skalę pilotażową.

 

Odniesienie

Wang Ling, Li Mengshi, Xu Sha i in.Ustalenie metody rozdzielania małych pęcherzyków pozakomórkowych metodą filtracji z przepływem stycznym w połączeniu z ultrawirowaniem. Chiński Journal of Biologicals, 2022, 35(9): 1096–1101. DOI: 10.13200/j.cnki.cjb.003713.